匙形古柏线虫染料法荧光定量PCR试剂盒 

                     Cooperia punctata

产品及特点： 

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。而荧光定量 PCR 的方法相应的可分为特异类和非特异类两类，特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行，为此本公司开发了简单快捷的匙形古柏线虫染料法荧光定量PCR检测试剂盒。

匙形古柏线虫染料法荧光定量PCR试剂盒产品优势：

1.随时可用。

2.优化的缓冲液可增强特异性并减少引物二聚体的形成。

3.高灵敏度，特异性和可靠性。

4.为不同的qPCR仪器提供了被动参考染料。

它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2. 根据匙形古柏线虫保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

匙形古柏线虫染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

运输及保存： 低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 ：DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

匙形古柏线虫染料法荧光定量PCR试剂盒使用方法 

一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备 

8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL上步制备的PCR 阳性对照的第4号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5拷贝/μL，10μL 相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout 或其升级版柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNAout。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个

样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光PCR仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

13. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。

15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。

五、荧光定量PCR技术的基础理论 ：

1、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析 、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析。

左图横坐标是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度Rn,改图反映的是各个样品随着 左图横坐标是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度Rn,改图反映的是各个样品随着 每轮PCR反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是PCR循环次数，纵坐标是 每轮PCR反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是PCR循环次数，纵坐标是 总的荧光强度与荧光本底的差值RT RB即△Rn的对数，在右图中确定阈值线，该直 总的荧光强度与荧光本底的差值RT –RB即△Rn的对数，在右图中确定阈值线，该直 线上所有样品的RT RB的对数都相同，荧光定量PCR的线性关系才会成立。 线上所有样品的RT –RB的对数都相同，荧光定量PCR的线性关系才会成立。