武汉思特进科技发展有限公司成立于2007年,是一家以实验技术研发、实验产品研发、日化产品研发、实验项目承接为一体的高新技术公司;公司实验中心有分子生物学平台、细胞平台、光镜平台、植物组培平台、原核蛋白表达平台、日化产品生产平台;可以开展各类动、植物、细菌、细胞等生物实验。
分别用70%乙醇和灭菌蒸馏水清洗金粉(直径为1 μm),加入灭菌蒸馏水制成金粉悬浮液,取100 μL 放在含有1.0 cm2 洋葱表皮的玻璃皿中,边振荡边加入10 μL pCambia2301-GaMYB2-GFP质粒,逐步加入40 μL 0.1 mol·L-1 亚精胺和100 μL2.5 mol·L-1 CaCl2,振荡混匀。基因枪GDS-80轰击时氦气罐的气压为1 300 psi,取10 μL DNA 包裹好的微粒悬浮液加到基因枪中央,进行轰击,之后放置25℃避光过夜培养,使用ConfocalLaser激光共聚焦显微镜观察。
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目的构建通用型植物GFP标签蛋白表达载体,研究蛋白质的细胞内定位对蛋白质组学和代谢组学等研究的意义。方法构建2种GFP标签蛋白质表达载体,分别在GFP的N和C端预留位点,以目的基因。利用该基因载体,分别内切酶Fok I的切割结构域与MS2噬菌体外壳蛋白MCP的串联蛋白(Fok I:MCP:Fok I,FMF)至GFP的N和C端,得到FMF与GFP的融合蛋白GFP:FMF和FMF:GFP,其中FMF的N端带有细胞核定位信号。利用农介导植物瞬时表达侵染本氏和洋葱表皮细胞,观察GFP荧光表达情况。结果成功构建了2种融合了目的基因和GFP的表达载体p ER35GFP-FMF和p ER35FMF-GFP。激光共聚焦结果显示侵染了只含GFP载体的农的细胞,可在细胞核和细胞质中检测到GFP的绿色荧光,而侵染了含核定位信号FMF:GFP和GFP:FMF 2种融合蛋白载体的农的细胞,只在细胞核中观察到绿色荧光。结论该载体系统可运用于研究蛋白质在植物细胞中的亚细胞定位,具有简单、和通用性的特点。
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